実験方法
サンプル調製
１．細胞や組織などの試料からDNA抽出キットを用いて、DNAを抽出します。
２．EzApplyDNA （6×濃度）１µLに、抽出したサンプル5μLを加えて混合します。
【パラフィルムを使用して試料調製する場合】
パラフィルム上にEzApplyDNAを1µL滴下し、そこに抽出したサンプル5μLを加え、ピペッティングで混合します（左図参照）。
ゲルの作製
サブマージ ミニでは、ゲルトレイ（Ｌ）1枚あたり25～40mL、（Ｓ）1枚あたり15～20mLのアガロースゲル溶液が必要です。
アガロースゲル溶液量はゲルの厚さにより異なり、最適なゲル厚は4～6mmです。
ゲルが厚いとバンドがぼやけて見えたり、バックグラウンドが高くなる原因にもなります。
１．分離するDNAの大きさに応じて、アガロースを目的濃度になるように秤量します（下表参照）。
| アガロースゲル濃度（w/v） |
分離するDNAのサイズ（bp） |
| 0.6% |
1,000～20,000 |
| 0.7% |
800～10,000 |
| 1.0% |
500～7,000 |
| 1.2% |
400～6,000 |
| 1.5% |
200～3,000 |
| 2.0% |
100～2,000 |
ゲルバッファー量（mL）×ゲル濃度（%）＝アガロース量（g）
例えば…1.0%のLサイズのアガロースゲルを作製したい場合
40ｍL（ゲルバッファー量）×1.0%（ゲル濃度）＝0.4g（アガロース量）
0.4gのアガロースを40mLのゲルバッファーに溶解し、ゲルを作製する。
２．１.にゲルバッファー（1×EzRunTAEまたは1×EzRunTBE）を必要量添加します。
３．電子レンジまたは湯せんで加熱し、アガロースを完全に溶解します。
※溶解後のアガロースゲル溶液は突沸する可能性があり、非常に高温のため、火傷をする恐れがあります。必ず耐熱手袋をして作業してください。
※加熱中のアガロースゲル溶液の突沸を防止するために、溶液量の2～５倍の三角フラスコやビーカーを使用することをお勧めします。
４．アガロースゲル溶液を約60℃くらいまで冷まします。
※高温のアガロースゲル溶液をゲルトレイに流しこむと、ゲルトレイが変形することがありますので、必ず冷ましてください。
５．適温に下がったアガロースゲル溶液をゲルトレイに流します。
※ゲル中に空気が入らないようにゆっくりと静かに注ぎいれます。
※空気が入ってしまった場合は、チップの先などでつついて、空気を除去します。
６．ゲル溶液が固まる前に、ゲルトレイにコウムをセットします。
７．ゴミが入らないようにラップをかけ、室温で30～60分静置してゲルを固めます。作製したゲルは1×EzRunTAEまたは1×EzRunTBEバッファー中で約１週間、冷蔵保存が可能です。
※EzPreStainDNA&RNAはゲル溶液、泳動bufferに添加による先染めが可能です。詳細は製品取扱説明書を参照ください。
電気泳動
１．作製したアガロースゲルをゲルトレイごと電気泳動槽（サブマージ ミニ、電源搭載型電気泳動装置）に入れます。
※ゲルトレイについた余分なゲルは取り除いておきます。
２．電気泳動槽に泳動バッファー（ゲル作製に使用したものと同じバッファー）を200～230mL入れます。
３．調製したサンプル溶液を空気が入らないように、ゆっくりアプライします。
４．上部カバーをセットします。
５．下表を参照し、泳動条件を設定して、スタートボタンを押して電気泳動を開始します。
| 設定電圧 |
設定時間 |
|
50V
|
60min |
| 100V |
30min |
| 150V |
20min |
ワンポイントアドバイス【泳動バッファーの量はゲルの上面より1～3mm上までいれる】
泳動バッファーの量が多すぎると、ゲル上面部位のバッファー中を流れる電気が多くなるため、泳動時間が長くなります。
また、泳動パターンの乱れの原因にもなりますので、バッファー量の入れすぎには注意が必要です。
ゲルの染色と撮影
１．50mLの1×EzRunTAEまたは1×EzRunTAEにEzFluoroStainDNAまたはEzPreStainDNA&RNAを5µL添加し、混合します。
※EzFluoroStainDNAやEzPreStainDNA&RNAが完全に溶解せず、不溶物が見られることがあります。
その場合は、まず蒸留水500µLでEzFluoroStainDNAまたはEzPreStainDNA&RNAを5µLを希釈し、その後1×EzRunTAEまたは1×EzRunTBEを添加し、50mLの染色液を作製します。
２．上部カバーを外し、ゲルをゲルトレイごと取り出します。
※電気泳動直後は、泳動バッファーが高温になることがあります。火傷に注意してください。
３．樹脂製のタッパーに染色液を入れ、その中に泳動後のゲルを入れて、浸漬します。この時ゲルトレイは外し、ゲルのみを染色液に入れます。
※必ず樹脂製のタッパーを使用します。ガラス容器を使用すると、蛍光試薬がガラスに吸着します。
４．タッパーをアルミホイルなどで遮光し、室温で10～30分間インキュベーションします。
５．インキュベーション後、ヘラなどを使用して、ゲルを慎重に取り出します。
※脱色操作は不要です。染色後の染色液は4℃で約1週間、遮光保存が可能です。
６．取り出したゲルは、撮影用トレイまたはラップの上にのせます。
７．ゲル撮影装置にゲルをセットし、Cyan LED またはUV光源で励起し、撮影します（下表参照）。
| UV励起 |
260～370nm |
フィルター：500～580LP |
| Cyan LED励起 |
440～500nm |
フィルター：500～580LP |
自作の場合
下表は、アガロースゲル電気泳動で使用する主な試薬の組成です。
より再現性良く、簡便に実験を行う際は、ぜひアトーの試薬をご利用ください。
| 試薬名 |
組成 |
| ローディングバッファ（5×Conc.） |
50% Glycerol,1mM EDTA（pH8.0）、0.25% Bromophenol Blue0.25%、Xylene Cyanol FF |
| TAE バッファー（50×Conc.） |
2M トリス、1M 酢酸、50mM EDTA |
| TBE バッファー（10×Conc.） |
500mM トリス、485mM ホウ酸、20mM EDTA |
| 染色液 |
10mg/mL エチジウムブロマイド、1×TAEまたは1×TBEバッファー |
エチジウムブロマイド（EtBr）を染色に使用する場合は、以下のような手順で行います。
エチジウムブロマイドは発がん性物質ですので、人体に接触しないように、取り扱いには十分気を付けてください。
１．50mLの1×EzRunTAEまたは1×EzRunTBEに50µLのエチジウムブロマイド（10mg/mL）を添加し、混合します。
２．染色液にゲルを浸漬し、アルミホイル等で遮光しながら5～30分間、染色します。
３．染色後、へら等を使用して、ゲルを慎重に取り出します。バックグラウンドが高い時は、蒸留水に浸し、30～60分脱色します。
４．ゲル撮影装置にゲルをセットし、UV照射で撮影します。
バンドがシャープになる、DNA電気泳動用ローディング試薬です（BPB、赤色色素入り）。WSE-7050 EzRun TAE¥9,800
トリス－酢酸系の電気泳動用バッファーです。WSE-7051 EzRunTBE¥5,800
トリス－ホウ酸系の電気泳動用バッファーです。WSE-1710 サブマージ ミニ¥43,800
電源搭載の小型サブマリン電気泳動装置です。DNAのアガロースゲル電気泳動等にご利用ください。WSE-1720 サブマージ マルチ¥63,800
電源搭載の小型サブマリン電気泳動装置です。DNAのアガロースゲル電気泳動等にご利用ください。WSE-7130 EzFluoroStain DNA¥19,800
電気泳動後のDNA検出用蛍光染色剤です。EtBrより高感度・安全にDNAを検出し、BlueLEDによる励起でより安全・高感度に検出できます。WSE-7135 EzPreStain DNA＆RNA¥15,800
ゲルや泳動バッファーに混ぜることで、DNAやRNAを蛍光染色しながら電気泳動可能な検出試薬です。