実験の流れ

ステップ			使用する製品
		１．サンプル調製 細胞や組織などからRIPA Lysisバッファー やSDSサンプルバッファーでタンパク質を抽出し、SDS処理および還元処理を行います。	タンパク質抽出・処理液 EzRIPA Lysis kit, EzApply, EzLabel FluoroNeo ブロックインキュベータ MyMiniBLOCK, PowerBLOCK
		２．電気泳動 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離します。目的タンパク質の分子量が不明な場合は濃度勾配ゲルを使用します。また転写効率の目安となる有色の分子量マーカーなどを使用します。発現量を比較する場合はコントロールサンプルを一緒に流します。	ゲル・電極液・マーカー  　ePAGEL HR, EzRun, EzProteinLadder 　電気泳動槽・パワーサプライ  　PageRun-Ace, MyPower
		３．トランスファー 電気泳動後、分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写します。	トランスファーバッファー EzFastBlot HMW 　トランスファーパック 　QBlot kitシリーズ 　ブロッター・パワーサプライ 　 HorizeBLOT
		４．ブロッキング タンパク質バンドがない膜表面に、抗体が非特異的に結合しないようにブロッキングします。	ブロッキング剤  　EzBlockChemi 　シェーカー  　SeesawShaker atto
		５．抗体反応、検出 ブロッキング後、抗体反応をし、ターゲットを検出します。	抗体・洗浄液  　EzTBS, EzTween 　発光・発色基質  　EzWestLumiOne 　化学発光撮影装置  　Luminograph I/II/III

実験方法

電気泳動～トランスファー

目的タンパク質の分子量が分離できるアクリルアミド濃度のゲルを使用し、目的タンパク質の転写に適した転写バッファーと方法を選択します。

電気泳動

転写

ブロッキングの準備

電気泳動からブロッティングを行っている間にブロッキングの準備をします。

ブロッキング溶液

ミニゲル1枚当たり50mL準備します。下表を参照して目的分子の検出法などからブロッキング溶液を選択します。

※EzBlock Chemi/BSA/CASは蒸留水で５倍希釈して使用します。EzBlock BSA/CASは試薬に添付されたTween20も1/100量添加します。
※スキムミルクは1~5%濃度でTBS-TあるいはPBS-Tに溶解してブロッキング溶液としています。（推奨ではありません）

洗浄液

ミニゲル1枚当たり500mL準備します。

抗体

一般的にターゲットタンパク質に対する１次抗体と検出用の酵素や蛍光が標識された２次抗体を準備します。１次抗体が直接標識されている場合は２次抗体は不要です。
抗体の希釈率は抗体や検出試薬の添付文書を参考にして決めます。サンプルや時間に余裕がある場合は、ドットブロッティングで適切な抗原の検出感度になるように希釈率を検討します。また抗体の希釈は抗体反応の直前に行います。抗体を希釈した状態で長時間置くと失活する場合があります。

膜のブロッキング方法

下記に従って、膜のブロッキング処理をします。　　　　　

	ブロッティング終了後、ブロッターのふたを外し、ゲルとブロッティング膜を回収します。
	≪オプション≫ 転写ムラや転写効率を調べるために、転写後ゲルに残っているバンドをCBB染色液で染色します。
	ブロッティング膜をTBS-T/PBS-Tに浸漬し、２０~３０秒間軽く洗浄します。 ※洗浄後のブロッティング膜は、風乾後、密閉して-20℃で保存できます。
	ブロッティング膜をブロッキング溶液に浸漬し、室温で~３０分間浸透しながらインキュベーションします。 ※ブロッキング時間が長くなるとオーバーブロックになり、検出感度が悪くなります。逆に短すぎると十分にブロッキングされず、バックグランドが上がったり、非特異的バンドが出現する要因になります。
	ブロッキング終了後、希釈した抗体溶液に浸漬します。

参考データ

実験例１　ブロッキングバッファーによる違い

上図はブロッキング剤による違いが（左から3%スキムミルク/TBS-T、EzBlock CAS、EzBlock BSA、EzBlock Chemi）実験結果に与える影響を検討した結果を示しています。Hela細胞抽出液を段階希釈して電気泳動し、EzFastBlotでP plus膜に転写後、それぞれのブロッキング剤で30分間ブロッキング処理を行なった後、SMAD2タンパク質に対する抗体で抗体反応を行い、EzWestLumi plusで検出しました。スキムミルクを使用した場合、シグナルが弱くなり、低濃度のバンドが検出しにくくなります（オーバーブロッキング）。EzBlock CASは主成分がスキムミルクのブロッキングに寄与するタンパク質でもあるカゼインから成りますが、精製カゼインタンパク質を使用しているため、低濃度のバンドもマスキングされずに検出できます。一方、EzBlock Chemiは主成分がタンパク質ではなく合成ポリマーから成りますが、バックグランドを抑え、非特異的なバンドの出現もなく、マスキングされずにタンパク質濃度に比例したシグナルを検出できることを示しています。このように、ブロッキング剤はバンドの検出感度や強度に大きな影響を与えることが判ります。

実験例２　ブロッキング時間による違い

上図はブロッキングの処理時間（左から５分間、１０分間、３０分間のインキュベーション時間）が実験結果に与える影響を検討した結果を示しています。Hela細胞抽出液を段階希釈して電気泳動し、EzFastBlotでP plus膜に転写後、それぞれEzBlock Chemiで５～３０分間ブロッキング処理を行なった後、SMAD2タンパク質に対する抗体で抗体反応を行い、EzWestLumi plusで検出しました。ブロッキング時間が５分間と短いとバックグランドが高く、非特異的なバンドが検出されますが、適正な時間行えばバックグランドを低く抑えられ、且つ各バンドを明瞭に検出できます。EzBlock Chemiを使用した場合、ブロッキング力が強いため上記の結果のように１０分間のブロッキング時間でも十分なブロッキング効果が得られます。もちろん３０分間ブロッキング処理を行った方が、非特異的なバンドが検出されず、バックグランドも抑えられますが、低濃度のタンパク質バンドはシグナル強度が若干弱くなります。しかしこれらの結果は、一概にブロッキング時間の影響だけでは説明できず、ブロッキング剤と膜およびサンプルによって左右されます。いずれにしても、ブロッキング時間はバンドの検出感度や強度に大きな影響を与えることが判ります。

実験例３　抗体剥離とブロッキング剤

上図はEzReprobeにより最初の検出で使用した抗体を剥離した後に、様々なブロッキング剤により（左から3%スキムミルク/TBS-T、EzBlock CAS、EzBlock BSA、EzBlock Chemi）再ブロッキングした際に、実験結果にどのような影響を与えるかを検討した結果です。Hela細胞抽出液を段階希釈して電気泳動し、EzFastBlotでP plus膜に転写後、EzBlock Chemiで30分間ブロッキング処理を行なった後、SMAD2タンパク質に対する抗体で抗体反応を行い、EzWestLumi plusで検出しました。EzReprobeと10分間インキュベーションして抗体を剥離し、再度上記のブロッキング剤でブロッキングを行いました。その後GAPDHに対する抗体と反応して、最終的に得たシグナルをEzWestLumi plusで検出した結果を上図は示しています。上記の結果のように、スキムミルクを使用した際はTarget 1の非特異的シグナルが除けず、EzBlockBSAを使用した場合は、非特異的バンドが検出される結果となりました。一方、EzBlockCASを使用すると、非特異的ハンドの出現が抑えられ、2回目の抗体反応によるシグナル（Target 2)が十分なシグナル強度で検出できます。このように、抗体剥離後のリプロービング前に行うブロッキングには、EzBlock CASを使用すると非特異的バンドの出現やバックグランドを抑えられ、きれいな結果を得ることができます。

実験例４　抗体剥離とブロッキング時間

上図はEzReprobeにより最初の検出で使用した抗体を剥離した後に再ブロッキングする際、ブロッキング時間によって実験結果にどのような影響を与えるかを検討した結果です。Hela細胞抽出液を段階希釈して電気泳動し、EzFastBlotでP plus膜に転写後、EzBlock Chemiで30分間ブロッキング処理を行なった後、SMAD2タンパク質に対する抗体で抗体反応を行い、EzWestLumi plusで検出しました。EzReprobeと10分間インキュベーションして抗体を剥離し、再度EzBlock CASで5分間、10分間、20分間インキュベーションして再ブロッキングを行いました（ブロッキングなし：再ブロッキングをせずに抗体反応を行った）。その後GAPDHに対する抗体と反応して、最終的に得たシグナルをEzWestLumi plusで検出した結果を上図は示しています。上記の結果のように、再ブロッキングをしない場合は非特異的バンドの出現が顕著になります。逆に再ブロッキングの時間は5分間でも十分な効果が得られ、時間を20分間まで伸ばすことにより、リプロービングしたTarget 2のシグナル強度は維持したまま、剥離した抗体（Target 1） の残存シグナルが弱くなり、きれいな結果が得られることが示されました。このように、抗体剥離後のリプロービング前に行うブロッキングは必須であり、短時間のブロッキング処理でも十分な効果が得られることが判ります。

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