ノーマライズとは

タンパク質のサンプルは不均一な上に、同じサンプルを同じ量だけアプライして電気泳動をしたとしても、レーン間の差は生じます。どんなに注意をしても、転写ムラや抗体反応のバラつきなども避けられません。そこで精度良く、再現性良く、定量的にウェスタンブロッティングを行う上で、ノーマライズというプロセスは必要不可欠になります。ウェスタンブロッティングのノーマライズでは、ターゲットタンパク質の輝度値を、リファレンスの輝度値から算出された各レーンの相対値（リファレンス比）で割って補正します。

ターゲットタンパク質の検出

①　電気泳動	②　ウェスタンブロッティング	③　データの解析
サンプル中に含まれるタンパク質は？ 電気泳動をするとサンプル中に含まれるタンパク質がバンドに分かれます。しかし、ターゲットタンパク質が、どのバンドなのかは判別できません。	ターゲットタンパク質は発現してるの？ ウェスタンブロッティングをするとターゲットタンパク質のバンドと量（輝度値）が分かります。分子量マーカーの移動度から、ターゲットタンパク質の分子量も推定できます。しかし、どのサンプルで最も多く発現しているのかは判断できません。	ターゲットタンパク質のバンドはどれ？ 電気泳動パターンとウェスタンブロッティングの検出バンドを重ねると、どのバンドがターゲットタンパク質なのかが判別できます。各レーンのトータルタンパク質の情報をリファレンスとして、サンプル中にどのくらい含まれるのか、どのサンプルで最も多く発現しているのかなども解析可能になります。

なぜノーマライズは必要？

これらの影響を最小限にするためノーマライズは必要です

ノーマライズのリファレンスには？

データノーマライズはターゲットタンパク質の発現量をリファレンスにより補正します

※ただし、ハウスキーピングタンパク質をリファレンスに使用するときは下記の注意が必要といわれています。
・実験条件によりリファレンスの発現量が影響されないこと
・リファレンスの発現量とターゲットタンパク質の発現量はかけ離れていないこと
・リファレンスの検出がターゲットタンパク質の検出を妨げないこと

ノーマライズによる定量

リファレンスの輝度値のレーン間での比（『リファレンス比』）を算出し、これをばらつきの補正係数とします。
[リファレンス比（ref.比）]＝ [各リファレンスの輝度値] ÷ [最初の番号のレーンのリファレンスの輝度値]

実験の流れ

下図はトータルタンパク質でノーマライズするための実験フローを示しています。トータルタンパク質 でノーマライズする場合、転写されたPVDF膜上のタンパク質バンドを視覚化する必要があります。PVDF膜上のタンパク質を検出する方法は大きく分けて①サンプル標識、②ステインフリーゲル、③転写後の膜染色があります。

関連製品

型式	製品名	取扱説明書	SDS	各種コンテンツ
AE-1430	SDS-PAGE用サンプル調製バッファー EzApply			電気泳動用の試料調製
WSE-7010	タンパク質用蛍光ラベル化・泳動サンプル処理キット EzLabel FluoroNeo			How to use 蛍光イメージング
WSE-4051	ブロッティング用PVDF膜（8.5×9cm） クリアブロット・P＋膜 M
WSE-4061	蛍光検出対応 PVDF膜（低蛍光）（8.5×9cm） クリアブロット・P膜（低蛍光） M

 EzLabel FluoroNeoを使用したトータルタンパク質 の検出

1.　サンプル調製　（EzLabel FluoroNeo）

EzLabel FluoroNeoはSDSサンプルバッファーの代わりに使うだけで、タンパク質の蛍光標識と電気泳動用サンプル調製ができます。電気泳動後のゲルは、染脱色不要で、すぐにバンドが蛍光検出できます。

2.　電気泳動

EzLabel FluoroNeoで標識した電気泳動サンプルは、一般的なゲル、泳動バッファー、泳動条件で分離できます。ここでは既製ゲル（ePAGEL-HR)を使用した、高速電気泳動に関してご紹介します。

3.　電気泳動パターンの確認(蛍光検出)

EzLabel FluoroNeoを使用した電気泳動後のゲルは、すぐに、Blue LEDあるいはCyanで励起することにより、バンドパターンを確認できます。

4.　転写

通常の転写条件で転写できます。PVDF膜は、自家蛍光の低い蛍光検出用のPVDF膜の使用が望ましいですが、一般的なPVDF膜でも検出可能です。特にBlue LED光源で検出する場合は、自家蛍光の影響が低減できます。ここでは高速転写バッファー（EzFastBlot）を使用した、高速転写に関してご紹介します。

5.　転写効率の確認(蛍光検出)

EzLabel FluoroNeoで調製したサンプルは、転写後のPVDF膜上のバンドもゲルと同様に蛍光検出できます。EzLabel FluoroNeoの蛍光強度は、タンパク質濃度と相関しているため、PVDF膜上のタンパク質バンドのシグナル強度をトータルタンパク質としてノーマライズに利用することが可能です。ノーマライズに関しては『ノーマライズの方法』を参照してください。

ステインフリーゲルを使用したトータルタンパク質 の検出

1.　サンプル調製（EzApply)

ステインフリーゲルを使用する場合も、電気泳動サンプルは通常の方法で調製します。有色マーカーは検出できないので、無色マーカーを併用します。

2.　電気泳動

ステインフリーゲルを使用して泳動します。プレキャストゲルを使用する場合は、取扱説明書に従ってください。ここでは、自作ステインフリーゲルを作製し、泳動する方法を紹介します。
ステインフリーゲル作製方法の詳細は下記Ladnerらの文献を参照してください。

参考文献
C.L. Ladner et al., Analytical Biochemistry 326 (2004) 13–20
Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining

3.　検出

電気泳動後のゲルは、すぐには蛍光検出できません。タンパク質を可視化するために、ゲルを直接UV照射装置の上に置き、約1分間照射します。UV波長は312nmを使用します。いったんUV照射で可視化したゲルの蛍光は比較的安定なので、蒸留水等でリンスしてゲルの状態を整えてから撮影すると、きれいな画像が得られ、電気泳動パターンが確認できます。

4.　転写

通常の転写条件で転写できます。PVDF膜は、自家蛍光の低い蛍光検出用のPVDF膜の使用が望ましいです。ここでは高速転写バッファー（EzFastBlot）を使用した、高速転写に関してご紹介します。

5.　転写効率の確認(蛍光検出)

可視化処理をしたステインフリーゲルは、転写後のPVDF膜上のバンドもゲルと同様に蛍光検出できます。PVDF膜上のタンパク質バンドのシグナル強度をトータルタンパク質としてノーマライズに利用することが可能です。ノーマライズに関しては『ノーマライズの方法』を参照してください。

トータルタンパク質 によるノーマライズの方法

1.　トータルタンパク質によるノーマライズ

EzLabelFluoroNeoやステインフリーゲルなどを使用して検出したトータルタンパク質をリファレンスとしてノーマライズします。リファレンスにはPVDF膜上の各レーンの転写されたタンパク質の総量（輝度値）を使用します。

2.　ノーマライズの手順

EzLabel FluoroNeoを使用する場合も、ステインフリーゲルを使用する場合も、同様の方法で画像を解析します。ノーマライズに必要な画像はPVDF膜上に転写されたトータルタンパク質のバンド(蛍光像または色素染色した場合は明視野像)と抗体反応後のターゲットタンパク質のバンド(発光像あるいは蛍光像など)です。まずPVDF膜上のトータルタンパク質の各レーンのバンド全体のシグナル強度を、続いてターゲットバンドのシグナル強度を定量します。ここでは画像解析ソフトCS Analyzer 4を使用して解析する方法を紹介します。解析手順としては① PVDF膜上のトータルタンパク質検出画像のスポット解析→② ターゲットタンパク質の検出画像のスポット解析→③ ノーマライズ計算の手順で行います。

3.　トータルタンパク質の解析

まずノーマライズ換算するためのリファレンスとなるトータルタンパク質を検出した蛍光撮影画像をスポット解析します。

①　各レーンの輪郭を囲む

各レーンの輪郭を『領域設定』⇒『四角』あるいは『ポリゴン』などを選択して囲みます。レーンが曲がっているときは、『ポリゴン』の方がより正確に囲むことができます。 またレーンの輪郭を囲む際は、泳動先端が含まれないようにします。泳動先端にはBPBなどの色素由来の非特異的なシグナルなどが含まれており、トータルタンパク質量を必ずしも反映しません。特にEzLabel FluoroNeoでラベルした場合は、ゲル濃度が高いとサンプル中の夾雑物やアミノ酸由来の非特異的シグナルが泳動先端に検出されますので、その部分を除いて囲みます。 CS Analyzer 4でノーマライズ解析する際は、リファレンスタンパク質の解析データとターゲットタンパク質のレーン番号が一致している必要があります。

②　バックグラウンドの設定

①で囲んだ領域以外のPVDF膜の余白部分にバックグラウンドを設定します。『四角』や『領域選択』でスポットと同様の領域を設定する、または『ポイント』によりレーン以外の余白に複数のポイントを設定する、などの方法があります。

③　解析およびデータ保存

解析ボタンをクリックしてバンドのシグナル強度を数値化し、さらに『解析情報保存』ボタンをクリックして解析結果を保存します。解析後のデータはCSV形式でも出力できます。

4.　ターゲットタンパク質の解析

次に抗体反応によりターゲットタンパク質を検出した発光（蛍光など）撮影画像をスポット解析します。解析方法はトータルタンパク質の解析方法と同様です。

①　バンドの輪郭を囲む

スポット解析により、ターゲットタンパク質のバンドの輪郭を『四角』あるいは『ポリゴン』を選択して囲みます。特に発光撮影像はコントラストによりバンドの強さと大きさが影響されますので、ある程度コントラストを上げた状態でバンドを囲むようにします。また、このとき、トータルタンパク質解析で設定したレーンの番号と解析する対象のバンドの番号は同じにしてください。ターゲットのバンド番号とノーマライズするレーン番号がずれると、バンド番号と同じ番号の別レーンのデータで誤った補正がされることになります。

②　バックグラウンドの設定

①で囲んだ領域以外のPVDF膜の余白部分にバックグラウンドを設定します。『四角』や『ポリゴン』でスポットと同様の領域を囲むか、『ポイント』を利用してレーン以外の余白に複数のポイントを設定します。

③　ノーマライズ解析

ターゲットタンパク質のバンドを囲み、バックグラウンドを設定したら、『解析』ボタンをクリックしてシグナル強度を数値化します。 　　　　　　 　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　 　　　　　 『ノーマライズ』ボタンをクリックして、リファレンスタンパク質（トータルタンパク質）の解析データを呼び出します。

リファレンスタンパク質の解析データが表示されますので、ノーマライズするバンドと同じ番号のトータルタンパク質のレーンをクリックして選択し『OK』します。ノーマライズの計測結果は、コピ－&ペースト、CSV形式での出力、もしくは解析データとして保存できます。

④　ノーマライズ値の定量解析

ノーマライズ結果を相対値として換算する場合は『定量』ボタンをクリックします。基準となるバンドをクリックして選択し『OK』します。『ノーマライズ値』を選択し、『１（もしくは任意の数）』と入力します。ノーマライズ値が相対値として換算されますので、コピ－＆ペースト、CSV形式による出力、もしくは解析データとして保存します。

ノーマライズ解析結果

1.　トータルタンパク質とハウスキーピングタンパク質によるノーマライズ定量結果の比較

下図はEzLabelFluoroNeoでラベルしたHeLa細胞抽出液からウェスタンブロッティングによりSMAD2タンパク質を検出したデータです。1/2希釈系列したサンプル中のSMAD2タンパク質の発現量を、トータルタンパク質およびハウスキーピングタンパク質でノーマライズした結果を示しています。

上図①のようにターゲットタンパク質とリファレンスタンパク質の検量線が直線で相関性が高い場合は、トータルタンパク質でもハウスキーピングタンパク質でも、ノーマライズした結果は理論値の1に近い値を示します。しかし一般的に②のようにハウスキーピングタンパク質は発現量が豊富なため、ターゲットタンパク質とは検量線の直線性ダイナミックレンジが異なります。そのためハウスキーピングタンパク質によりノーマライズした結果は理論値から外れる場合があります。

2.　EzLabelFluoroNeoとステインフリーゲルによるサンプル標識の比較

EzLabelFluoroNeoとステインフリーゲルにより検出したバンドを、ゲル、転写後のPVDF膜の蛍光検出像（膜_蛍光）、とCBB染色像（膜_CBB) で比較した結果を示しています。バンドを比較しやすいように、各イメージをグレースケールで表示しています。

『膜_蛍光』のレーンは、EzLabelFluoroNeoもしくはステインフリーゲルの蛍光色素で標識されたバンドを検出した結果を示しています。EzLabelFluoroNeoで検出すると（上図）、泳動先端にサンプル中のアミノ酸などに由来する非特異的なシグナルが見えますが（赤丸で表示）、検出されるバンドの数やシグナルの強さは、ほぼ同等です。EzLabelFluoroNeoは第１、第２アミンが標識されるため、ほぼ全てのタンパク質が同等に標識されるためです。一方、ステインフリーゲルはアミノ酸のうちトリプトファンが標識されるため、トリプトファンの有無や数によりシグナルの強さが変わります（上図）。そのため、蛍光検出とCBB検出でバンドパターンがやや異なります。＊で示したバンドは、蛍光検出とCBB検出で検出感度が顕著に異なるバンドを示しています。

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